Mètodes d'investigació de biologia molecular i el seu ús

biologia molecular mètodes d'investigació tenen un paper important en la medicina moderna, la ciència forense, i la biologia. Gràcies als avenços en l'estudi d'ADN i ARN, la persona és capaç d'explorar el genoma de l'organisme determinar l'agent causal, per reconèixer l'àcid nucleic desitjat en una barreja d'àcids, etc.

mètodes de biologia molecular. Què és?

Allà pels 70-80 dels científics va ser el primer a desxifrar el genoma humà. Aquest esdeveniment va donar impuls al desenvolupament de l'enginyeria genètica i la biologia molecular. Estudi de les propietats d'ADN i ARN ha significat que ara és possible utilitzar aquests àcids nucleics per al propòsit de diagnòstic de la malaltia, el gen d'estudi.

Preparació d'ADN i ARN

biològics moleculars mètodes de diagnòstic sovint això: requereixen material de partida d'àcid nucleic. Hi ha diverses maneres de seleccionar aquestes substàncies a partir de les cèl·lules dels organismes vius. Cada un té els seus avantatges i desavantatges, i s'ha de considerar l'hora de triar un mètode d'aïllament d'àcids nucleics en forma pura.

1. Preparació d'ADN per Marmur. El mètode consisteix en el tractament de la barreja de substàncies d'alcohol, precipitats resultants ADN pur. El desavantatge d'aquest mètode és l'ús de substàncies corrosives, fenol i cloroform.

2. Aïllament de l'ADN en la ploma. La substància principal que s'utilitza aquí - és tiocianat de guanidina (GuSCN). Promou la deposició de àcid desoxiribonucleic sobre substrats especialitzats, de la qual pot ser posteriorment recollit per mitjà d'un tampó especial. No obstant això GuSCN - és un inhibidor de la TCP, i fins i tot una petita part que es diposita en l'ADN pot influir en el curs de la reacció en cadena de polimerasa, que és important quan es treballa amb els àcids nucleics.

3. La precipitació d'impureses. El mètode difereix de les anteriors en què les molècules de si mateixos no es dipositen àcid dehoksiribonukleinovoy i impureses. Per això, utilitzeu els intercanviadors d'ions. El desavantatge és que no totes les substàncies poden assentar-se.

4. Cribratge. Aquest mètode s'utilitza en els casos en què no és necessari disposar d'informació precisa sobre l'estructura de la molècula d'ADN, i la necessitat d'obtenir algunes estadístiques. La raó és que l'estructura de l'àcid nucleic pot ser danyat quan el maneig dels detergents, en particular àlcalis.

Classificació dels mètodes d'investigació

Tots els mètodes de biologia molecular de la investigació es divideixen en tres grups principals:

1. L'amplificació (usant una pluralitat d'enzims). Això inclou PCR - reacció en cadena de la polimerasa, que té un paper important en molts dels mètodes de diagnòstic.

2. Neamplifikatsionnye. Aquest grup de mètodes està directament associat amb el treball de mescles d'àcid nucleic. Exemples són 3 classes blots, hibridació in situ, etc.

3. Els mètodes basats en el reconeixement del senyal de la molècula de sonda, que s'uneix a una sonda d'ADN o ARN específica. Exemple - sistema d'hibridació en solució sistema de captura de Hybride (HC2).

Els enzims que es poden utilitzar en mètodes d'investigació de biologia molecular

Moltes de les tècniques de diagnòstic molecular impliquen l'ús d'una àmplia gamma d'enzims. A continuació s'utilitzen amb més freqüència:

1. enzim de restricció - "tallar" la molècula d'ADN a les parts necessàries.

2. ADN polimerasa - sintetitza una molècula d'àcid desoxiribonucleic de doble cadena.

3. La transcriptasa inversa (transcriptasa inversa) - s'utilitza per sintetitzar ADN a partir d'una plantilla d'ARN.

4. ADN ligasa - és responsable de la formació d'enllaços fosfodiéster entre nucleòtids.

5. exonucleasa - elimina nucleòtids a partir de les porcions d'extrem de la molècula d'àcid desoxiribonucleic.

PCR - el mètode bàsic de l'amplificació d'ADN

reacció en cadena de la polimerasa (PCR) s'utilitza àmpliament en la biologia molecular moderna. Aquest mètode, en el qual una sola molècula d'ADN es pot obtenir un gran nombre de còpies (molècula d'amplificació).

Les funcions principals de PCR:

- diagnòstic de malalties;

- la clonació de segments d'ADN, Gene.

Per dur a terme la reacció en cadena de la polimerasa requereix els següents elements: molècula d'ADN inicial, un ADN polimerasa termoestable (Taq o Pfu), fosfats de desoxirribonucleòtids (fonts de bases de nitrogen), els encebadors (2 encebadors 1 molècula d'ADN) i en si mateix un sistema tampó que pot conduir totes les reaccions.

PCR consta de tres etapes: desnaturalització, hibridació de l'encebador i l'allargament.

1. desnaturalització. A una temperatura de 94-95 graus Celsius proshodit trencar els enllaços d'hidrogen entre les dues cadenes d'ADN, i com a resultat s'obtenen dues molècules monocatenàries.

2. encebadors hibridats. A una temperatura de 50-60 graus centígrads passa encebadors d'adhesió en els extrems de molècules d'àcid nucleic de cadena senzilla d'acord amb el tipus de complementarietat.

3. L'elongació. A una temperatura de 72 graus és la filla de doble cadena sintetitzat molècules d'àcid desoxiribonucleic.

La seqüenciació d'ADN

mètodes d'investigació de biologia molecular sovint requereixen coneixement de la seqüència de nucleòtids en una molècula d'àcid desoxiribonucleic. Per determinar el codi genètic seqüenciat. El diagnòstic molecular del futur es basaran en els coneixements adquirits en la determinació de la seqüència humana.

Els següents tipus de seqüenciació:

• seqüenciació pel Maxam-Gilbert;
• seqüenciació de Sanger;
• piroseqüenciació;
• seqüenciació nanoporovoe.